Ultrafiltração de fibra oca de 300 kd: análise de um processo de concentração e purificação de alta-eficiência para vírus O/A de febre-e{3}}bocal

Introdução

A febre-e-aftosa (FA) é uma doença animal aguda, febril e altamente contagiosa causada pelo vírus da febre-e{3}}da febre aftosa (FA). Esse vírus afeta animais-de cascos fendidos, com mais de 70 espécies suscetíveis. Ela se espalha rapidamente e tem uma alta taxa de morbidade, afetando normalmente os principais rebanhos, como suínos, ovinos e bovinos, onde a incidência pode chegar a 100%. O FMDV pertence ao gêneroFebre-e-vírus bucalda família MicroRNAviridae. As partículas são esféricas, com aproximadamente 27-30 nm de diâmetro, com coeficiente de sedimentação de 146S para partículas virais intactas. Atualmente, várias vacinas contra a febre aftosa estão disponíveis, incluindo vacinas de vírus vivos atenuados, vacinas de vetores de vírus vivos, vacinas inativadas, vacinas de ácidos nucleicos, vacinas de peptídeos sintéticos e vacinas de subunidades. As vacinas inativadas contra a febre aftosa geralmente têm menos efeitos colaterais em animais, e as vacinas multivalentes oferecem melhor eficácia de imunização, tornando-as a base da prevenção da febre aftosa na China.

Ultrafiltração de Fluxo Tangencial

Atualmente, a ultrafiltração de fluxo tangencial é um método de purificação e concentração comumente usado na produção em grande-escala de vacinas-inativadas multivalentes contra febre aftosa. Este método não apenas atinge o fator de concentração desejado, mas também remove uma grande quantidade de impurezas estranhas. A ultrafiltração de fluxo tangencial é usada principalmente para purificação, concentração e filtração ( dessalinização e substituição de tampão). Além disso, também pode ser utilizado para a clarificação de caldo de fermentação ou meio de cultura celular por meio de microfiltração de fluxo tangencial, substituindo assim a centrifugação ou clarificação primária.

Na filtração vertical convencional, moléculas grandes tendem a agregar-se na superfície da membrana, obstruindo o filtro. A filtração de fluxo tangencial, entretanto, permite que o fluxo prossiga paralelamente à membrana, evitando esse problema de entupimento. Durante a filtração de fluxo tangencial, o solvente e as substâncias menores que o tamanho dos poros da membrana que permeiam através da membrana são chamados de permeado, enquanto as substâncias maiores que o tamanho dos poros são retidas como concentrado. Combinado com processos otimizados de lavagem e filtração, a separação e purificação de moléculas de tamanhos variados pode ser alcançada. Essa tecnologia oferece vantagens como baixo custo, condições operacionais amenas, limpeza e substituição convenientes, alta taxa de fluxo de permeado de membrana e operação simples, tornando-a particularmente adequada para concentração e purificação em grande-escala de substâncias bioativas.

Materiais e métodos

Resultados e Discussão

Em termos de purificação inicial do vírus, a concentração de ultrafiltração atinge uma taxa de remoção superior a 90% para impurezas como proteínas que não contêm vírus. Em termos de volume, pode atingir altas concentrações de 10 a 50 vezes, proporcionando forte suporte para posterior purificação. Uma coluna de fibra oca com peso molecular de corte de 300 kd é selecionada. Este tamanho de poro, embora retenha mais de 85% do vírus, pode remover mais de 90% das impurezas proteicas. A área da membrana é de 1600 cm² e o rendimento é de 2-5 mL/cm², permitindo que a concentração da ultrafiltração seja concluída dentro de um tempo eficaz (dentro de 2 horas). Dados detalhados de concentração de ultrafiltração e purificação são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Resultados da detecção total de antígenos-de febre aftosa (tipos O e A)

Considerações sobre o método de purificação

Atualmente, existem vários métodos de purificação, mas mesmo com o mesmo método para o mesmo antígeno, o efeito de purificação é muitas vezes insatisfatório por muitas razões, incluindo a caracterização do antígeno e os parâmetros do processo. Por exemplo, alterações no design molecular a montante ou nos sistemas de cultura de fermentação podem alterar a estrutura molecular viral, levando a resultados de purificação insatisfatórios. Métodos de clarificação inadequados podem aumentar os custos da matéria-prima ou a quantidade de proteína heteróloga, aumentando a pressão na purificação a jusante. Concentrações inadequadas de ultrafiltração, como diferentes tamanhos de poros da membrana de ultrafiltração, fatores de concentração e eluição, taxas de fluxo de entrada, taxas de filtração e TMP, podem resultar em baixas taxas de recuperação de antígeno. A prática extensiva mostra que uma purificação deficiente pode causar reações adversas significativas em animais após a imunização, podendo levar à morte.