Estudo de otimização do processo de purificação a jusante do líquido de colheita de embriões de galinha para o vírus da gripe tipo IV (parte 1)

A gripe (também conhecida como gripe) é uma doença infecciosa respiratória altamente contagiosa que pode causar uma variedade de doenças respiratórias. De acordo com dados oficiais da Organização Mundial da Saúde (OMS), aproximadamente um bilhão de pessoas são ameaçadas pelos vírus da gripe a cada ano. Os vírus influenza (IVs) pertencem à família Orthomyxoviridae e são vírus de RNA de cadeia simples-de sentido negativo-. As partículas do vírus influenza são esféricas, com diâmetro de 80-120 nm, e sua estrutura pode ser dividida em três camadas de fora para dentro: um envelope, proteínas da matriz e um núcleo.

 

Estrutura dos vírus influenza A e B

Os medicamentos antivirais e a vacinação direta contra a gripe são passos cruciais no atual tratamento e prevenção da gripe. Atualmente, a matriz de embriões de galinha e a matriz celular são métodos comumente usados ​​na pesquisa de vacinas contra influenza, sendo os embriões de galinha a escolha mais frequentemente escolhida para preparar o fluido do vírus da gripe por pesquisadores nacionais e internacionais. O fluido do vírus alantóico do embrião de galinha contém inúmeras impurezas, como ovalbumina e proteínas estruturais virais. A ovalbumina é um componente significativo que pode causar reações alérgicas em indivíduos-imunizados com vacina. Portanto, a clarificação, concentração e purificação do fluido do vírus alantóico do embrião de galinha são etapas essenciais no desenvolvimento de vacinas contra o vírus da gripe.

Atualmente, a tecnologia de clarificação de fluidos de colheita de vírus comumente usada é centrifugação + filtração profunda. Os principais métodos para purificar o vírus influenza incluem ultrafiltração, ultracentrifugação, cromatografia de filtração em gel e cromatografia combinada.

Este estudo tem como objetivo investigar as características de infecção de quatro vírus influenza -H1N1, H3N2, BV e BY-em embriões de galinha com 9 a 11 dias de idade. O fluido alantóico viral monovalente foi obtido através da cultura de embriões de galinha para fornecer um material básico para subsequente processamento viral a jusante. Durante o estudo, diferentes métodos de clarificação, concentração e purificação foram comparados para otimizar a separação da proteína alvo de outros componentes (como proteínas diversas e ovalbumina).

Roteiro de tecnologia experimental

Os embriões de galinha foram cultivados a 37 graus durante 9-11 dias. Eles foram então inoculados com vírus influenza A (A1 para H1N1, A3 para H3N2) em um MOI de 1:10.000 e vírus influenza B (B1 para BV, B2 para BY) em um MOI de 1:10.000. Os vírus H1N1 e H3N2 foram cultivados a 33-34 graus por 48 horas, enquanto os vírus BV e BY foram cultivados a 33 graus por 7,2 horas. Os embriões foram então resfriados e o fluido alantóico foi colhido. O fluido alantóico apresentava alto teor de proteínas totais, alta viscosidade e parecia turvo, dificultando a clarificação.

Efeitos de diferentes processos de esclarecimento na qualidade do fluido de colheita do vírus influenza do tipo IV

A clarificação é uma etapa essencial no processo de purificação, servindo como pré-tratamento preliminar para um grande número de impurezas insolúveis. Esta etapa utiliza fluido alantóico como matéria-prima. Após centrifugação de fluxo contínuo em alta-velocidade, o fluido é clarificado e filtrado através de cartuchos de filtro com tamanhos de poros de 3μm e 0.8+0.45μm e 3μm e 0.8+0.65μm. Os efeitos dos dois tamanhos de cartucho de filtro no processo de clarificação e nos resultados são investigados, e um esquema de clarificação adequado é selecionado para determinar o processo de clarificação ideal.

Os resultados dos quatro tipos de testes de fluido de clarificação do vírus influenza são mostrados nas Figuras 1-3 . CA1-1 representa os resultados do fluido de clarificação testado usando cartuchos de filtro de 3μm e 0.8+0.65μm, CA1-2 representa os resultados do fluido de clarificação testado usando cartuchos de filtro de 3μm e 0.8+0.45μm, e o restante é semelhante.

Figura 1. Resultados de detecção da solução clarificada do vírus influenza - conteúdo total de proteínas

Figura 2. Resultados de detecção da solução clarificada do vírus influenza - título de hemaglutinação

Figura 3. Resultados de detecção da solução clarificada do vírus influenza - taxa total de remoção de proteínas

Os resultados mostraram que embora houvesse diferenças numéricas no conteúdo de proteína total e na taxa de remoção de proteína total entre os grupos, não houve diferenças significativas. Isto pode ocorrer porque os tamanhos dos poros dos cartuchos de filtro eram muito pequenos e todos poderiam atender aos requisitos de clarificação. Em relação ao título de coagulação sanguínea, os cartuchos filtrantes de 3μm e 0.8+0.45μm apresentaram maiores títulos de coagulação sanguínea. Portanto, os tamanhos de poros menores dos cartuchos de filtro de 3μm e 0.8+0.45μm foram selecionados para uma clarificação ideal.

Referências: Huang, Zhentian. Otimização do processo de produção downstream para vacina quadrivalente do vírus influenza dividido [D]. Universidade Agrícola de Shenyang, 2024. DOI:10.27327/d.cnki.gshnu.2024.001595.