Estudo de otimização do processo de purificação a jusante do caldo de colheita de embriões de galinha para o vírus da gripe tipo IV (parte 2)

Os efeitos de diferentes processos de concentração de ultrafiltração na qualidade do fluido clarificado do vírus influenza tipo IV

O concentrado do vírus influenza possui grande volume, baixo teor de hemaglutinina e altos níveis de impurezas e proteínas, necessitando de concentração de ultrafiltração antes do processamento subsequente . A ultrafiltração é o método preferido para concentrações de produção moderadas e em grande-escala. Estudos demonstraram que um sistema de fibra oca de 750 kDa pode reduzir significativamente o teor de ovalbumina do concentrado, enquanto outro estudo indica que um sistema de encapsulamento por membrana de 1000 kDa pode reduzir significativamente as impurezas e proteínas no concentrado de gripe aviária. Depois de revisar extensa literatura e comparar dois dispositivos de concentração de ultrafiltração comumente usados, o sistema de fibra oca de 750 kd e o sistema de encapsulamento de membrana de 1000 kd, com todas as condições idênticas, exceto para o sistema operacional, o processo ideal de concentração de ultrafiltração foi determinado com base nos resultados do teste.

Os resultados do teste são mostrados na Figura 4-9. UA1-1 representa a média de três lotes de concentrado de ultrafiltração filtrado usando um sistema de fibra oca de 750 kd, UA1-2 representa a média de três lotes de concentrado de ultrafiltração filtrado usando um sistema de membrana de 1000 kd e assim por diante.

Figura 4. Resultados de detecção do concentrado do vírus influenza - conteúdo total de proteína

Figura 5. Resultados de detecção de concentrado de vírus influenza - conteúdo de ovalbumina

Figura 6. Resultados de detecção de concentrado de vírus influenza - taxa total de remoção de proteínas

Figura 7. Resultados de detecção do concentrado do vírus influenza - título de hemaglutinação

Figura 8. Resultados de detecção de concentrado de vírus influenza - concentração, rendimento de título

Figura 9. Resultados de detecção do concentrado do vírus influenza - conteúdo de hemaglutinina

 

Os resultados mostraram que os níveis de endotoxinas bacterianas em todos os grupos do concentrado do vírus influenza estavam abaixo de 60 EU/mL. Não houve diferenças estatisticamente significativas no teor de ovalbumina, título de hemaglutinação, teor de hemaglutinina e rendimento do título de concentração, o que pode estar relacionado à estrutura do vírus influenza. No entanto, o tratamento com o sistema de membrana de 1000 kDa mostrou uma redução no conteúdo total de proteínas das cepas influenza V e BY, bem como uma diminuição na taxa de remoção total de proteínas das cepas influenza H3N2 e BY. Além disso, o sistema de membrana de 1000 kDa demorou menos tempo para concentrar o mesmo volume de solução clarificada, demonstrando uma vantagem em termos de custo de tempo. Portanto, o sistema de membrana de 1000 kDa foi escolhido para a concentração de ultrafiltração do concentrado de vírus influenza de cepas de influenza V.

 

Efeitos de diferentes proporções de concentração na qualidade da solução clarificada do vírus influenza do tipo IV

O fator de concentração é uma etapa crucial na purificação, intimamente relacionada ao rendimento da proteína alvo, ao tempo de concentração e à segurança do sistema de concentração. Um sistema de encapsulamento de membrana de 1.000 kDa foi escolhido para estudos de concentração de ultrafiltração. . 60 L de fluido alantóico de cada um dos quatro tipos de vírus influenza (UA1, UA3, UB1 e UB2) foram coletados e submetidos a centrifugação de fluxo contínuo e clarificação em vários-estágios para obter 54 L de solução clarificada de cada um. Cada solução clarificada foi dividida em nove grupos de 6 L cada, e fatores de concentração de 30, 40 e 50 foram investigados, com cada fator repetido três vezes para verificar a repetibilidade e estabilidade. Os volumes finais correspondentes foram 0,2 L, 0,15 L e 0,12 L, respectivamente.

, amostras foram coletadas para testar o teor de proteína total, taxa de remoção de proteína total, título de hemaglutinação, rendimento do título de concentração e teor de hemaglutinina. Os resultados do teste são mostrados na Figura 10-14 .

 

Figura 1.0 Resultados da concentração da solução clarificada do sorotipo 4 do vírus influenza em diferentes proporções de concentração - conteúdo de proteína total

Figura 1.1 Resultados da concentração da solução clarificada do vírus influenza tipo IV após diferentes proporções de concentração - taxa de remoção de proteína total

Figura 12. Resultados de detecção de fluido clarificado do sorotipo IV do vírus influenza após concentração em diferentes proporções de concentração - título de hemaglutinação

Figura 1.3 Resultados da concentração da solução clarificada de vírus influenza de diferentes tipos após diferentes proporções de concentração - título de concentração e rendimento

Figura 14. Resultados de detecção do conteúdo de hemaglutinina na solução clarificada do vírus influenza tipo IV após concentração em diferentes proporções de concentração.

 

Os resultados mostraram que, para diferentes proporções de concentração, razões de concentração mais baixas indicaram menor teor de proteína total e taxa de remoção de proteína total, bem como menores títulos de hemaglutinação, rendimentos de títulos de concentração e teor de hemaglutinina. Razões de concentração mais elevadas poderiam evitar estes problemas, mas colocaram exigências mais elevadas no sistema, aumentaram a pressão operacional do sistema e potencialmente aumentaram as perdas. Além disso, o aumento da pressão levou a tempos de produção mais longos, aumentando assim os custos de tempo. Considerando todos os fatores, uma proporção de concentração de 30 a 40 vezes foi ideal.

 

O efeito de diferentes processos de purificação na qualidade do vírus influenza concentrado do tipo IV

Os resultados mostraram que a purificação do Capto Core 700 produziu maiores taxas de remoção de proteína total e ovalbumina, e menor teor de proteína total e ovalbumina, mas menor teor e rendimento de hemaglutinina. A centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, por outro lado, alcançou maior teor e rendimento de hemaglutinina . Além disso, o rendimento de hemaglutinina do Capto Core 700 foi consistentemente acima de 50%, ligeiramente inferior ao da centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. No entanto, considerando que a centrifugação em gradiente de densidade de sacarose requer dessacarificação após a purificação, é mais demorada-e resulta em maiores perdas, o Capto Core 700 é o método preferido. O método de purificação Core 700 é superior como método de purificação para vírus influenza concentrado do tipo IV.

Referências: Huang, Zhentian. Otimização do processo de produção a jusante para vacina quadrivalente do vírus influenza dividido [D]. Universidade Agrícola de Shenyang, 2024. DOI:10.27327/d.cnki.gshnu.2024.001595.