Aplicações experimentais e soluções de solução de problemas para tubos centrífugos de ultrafiltração

Um tubo centrífugo de ultrafiltração é um dispositivo de filtração por membrana comumente usado em laboratório. Seu componente principal é uma membrana de ultrafiltração com limite de peso molecular específico. Os materiais comuns de membrana de ultrafiltração incluem polietersulfona (PES) e celulose regenerada (RC). O princípio de funcionamento do tubo centrífugo de ultrafiltração é usar força centrífuga e peneiramento com base em-tamanho-molecular para conduzir pequenas moléculas através da membrana de ultrafiltração, permitindo assim rápida concentração, dessalinização, troca de buffer ou purificação e separação de biomacromoléculas, como proteínas e ácidos nucleicos.

 

Seleção MWCO

Proteína	MWCO recomendado	Tempo de centrifugação recomendado
6–20 kDa	3 kDa	40 minutos
20–30 kDa	5kDa	30 minutos
30–60 kDa	10 kDa	20 minutos
60–100 kDa	30 kDa	20 minutos
100–200 kDa	50 kDa	15 minutos
200–600 kDa	100 kDa	15 minutos
>600 kDa	300 kDa	15 minutos
Moléculas de ácido nucleico de cadeia simples- ou dupla-	MWCO recomendado	Tempo de centrifugação recomendado
137–1159 pb	30 kDa/100 kDa	10 min (rotor de ângulo-fixo, 5.000 × g)
Nanoesferas	MWCO recomendado	Tempo de centrifugação recomendado
1,5–2nm	3 kDa	40 minutos
2–3nm	5kDa	30 minutos
3–5nm	10 kDa	20 minutos
5–7nm	30 kDa	20 minutos
7–10nm	50 kDa	15 minutos
10–30nm	100 kDa	15 minutos
>30nm	300 kDa	15 minutos

 

Para proteínas, recomenda-se selecionar um MWCO de membrana que seja 2 a 6 vezes menor que o peso molecular da proteína alvo. Se a taxa de fluxo também for considerada, recomenda-se um MWCO de membrana abaixo desta faixa de 2×–6×.

 

Caso de Aplicação (DNA de Shed Cells)

Para o método convencional, um pedaço de gaze de 2,5 cm x 2 cm foi cortado, lisado em um sistema de pequeno-volume e purificado diretamente com o instrumento. Para o método de concentração, a área de amostragem da gaze foi duplicada. Após a lise, o sobrenadante da digestão foi transferido para um tubo centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa, concentrado por centrifugação a 10.000 r/min, recuperado por centrifugação invertida e depois submetido à extração de DNA utilizando um instrumento de purificação de ácido nucleico totalmente automatizado. O volume de eluição foi uniformemente ajustado para 40 μL para garantir que os níveis iniciais de células nos dois grupos fossem essencialmente comparáveis.

 

Os testes quantitativos mostraram que a concentração média de DNA foi de 0,099 ± 0,041 ng/μL para o método convencional e 0,193 ± 0,068 ng/μL para o método de concentração. A diferença entre os dois grupos foi estatisticamente significativa (P <0,01). O rendimento total de DNA obtido com o método de concentração foi 1,95 vezes maior que o do método convencional, demonstrando que a etapa de concentração de ultrafiltração quase não causou perda de DNA total. Os valores de Ct dos dois grupos foram 27,64 ± 0,39 e 27,58 ± 0,40, respectivamente, com P > 0,01, indicando que o tratamento de ultrafiltração não introduziu inibidores de amplificação por PCR nem interferiu nas reações de amplificação subsequentes.

 

Para a genotipagem de STR, um genótipo completo foi definido por bandas completas em cada locus e uma altura média de pico maior ou igual a 200 RFU. Entre 20 amostras paralelas, o método convencional produziu genótipos completos para apenas 14 amostras, enquanto o método de concentração alcançou a genotipagem STR completa para todas as 20 amostras, melhorando significativamente a taxa efetiva de detecção de genotipagem de amostras de traços de contato.

Os tubos centrífugos de ultrafiltração da Guidling Technology apresentam operação simples, altos fatores de concentração e altas taxas de recuperação de amostras e são amplamente utilizados em bioquímica, biologia molecular e outros campos. A taxa de recuperação dos tubos centrífugos de ultrafiltração da Guidling Technology varia dependendo do material que está sendo processado e geralmente pode exceder 90%.

 

Solução de problemas comuns

Problema	Possível causa	Solução
A precipitação ocorre durante a concentração	A concentração é muito rápida	Reduza a velocidade de centrifugação
		Use um tubo de ultrafiltração com corte de peso molecular mais alto
		Pipetar para cima e para baixo no tubo centrífugo e centrifugar novamente
	Excesso-de concentração	Recomenda-se que a concentração final de proteína após concentração não exceda 20 mg/mL
A água não pode ser filtrada através	A membrana de ultrafiltração está completamente seca e a superfície da membrana torna-se fracamente hidrofóbica	Umedeça a membrana com um solvente de baixa tensão-superficial- (por exemplo, realize a centrifugação inicial com 20% de etanol em água)
Nenhuma proteína alvo está presente no concentrado	A concentração inicial da amostra de proteína é muito baixa (< 25 μg/mL)	Se a concentração da amostra for baixa e o volume for grande, carregue repetidamente a amostra e centrifugue
	Seleção incorreta de MWCO de membrana	O MWCO da membrana é geralmente inferior a 2 vezes o peso molecular da proteína alvo ou superior
	A força centrífuga está fora da faixa especificada	Força centrífuga recomendada: 3.000–5.000 × g
	A proteína alvo precipitou	Ajuste a concentração de proteína alvo no concentrado (ajuste o fator de concentração)
		Controle a temperatura e o pH
		Use aditivos
		Ajuste a força iônica
A interferência ocorre durante a análise downstream de proteína concentrada	A membrana de ultrafiltração contém vestígios de glicerol	Pré-enxágue o tubo de ultrafiltração com tampão e água purificada. Se a interferência persistir, limpe com NaOH 0,1 M, depois enxágue com água purificada e centrifugue
Contaminação por RNase	Não há garantia de que o tubo de ultrafiltração esteja livre de RNase-	Recomenda-se mergulhar em DEPC 0,1% a 37 graus por 2 horas para inativar completamente a RNase; DEPC residual pode ser removido enxaguando com água purificada
Contaminação por endotoxina	Os tubos de ultrafiltração fornecidos não foram submetidos a tratamento de{0}remoção de endotoxinas, e as endotoxinas estão amplamente presentes na natureza	Antes do experimento, faça-limpeza prévia com NaOH 0,5 M, seguida de enxágue com água purificada para remover a maioria das endotoxinas