Avanço Científico|Processo de separação e purificação para colágeno tipo II humanizado recombinante

O colágeno tipo II é uma proteína estrutural encontrada principalmente no tecido cartilaginoso. Fornece suporte e amortecimento para as articulações e ajuda a manter as propriedades mecânicas e a integridade estrutural da cartilagem. Tem um potencial de aplicação significativo nos cuidados de saúde das articulações e na engenharia de tecidos cartilaginosos.

 

Comparado com os métodos tradicionais de extração, o colágeno recombinante produzido através da fermentação microbiana do hospedeiro oferece qualidade estável, boa biocompatibilidade e nenhum risco de contaminação viral, tornando-o um importante foco de pesquisa. O colágeno tipo II humanizado recombinante produzido por fermentação usando *Pichia pastoris* projetado atraiu considerável interesse de pesquisa. No entanto, o alto custo e a complexidade da separação e purificação continuam sendo grandes desafios no estabelecimento de um processo eficiente para a produção-em escala industrial de colágeno recombinante.

 

Uma equipe de pesquisa da Escola de Ciências da Vida e Engenharia Médica da Universidade de Anhui, em colaboração com a Anhui Zhongsheng Anlan Health Industry Co., Ltd., desenvolveu um processo completo de separação e purificação para colágeno II humanizado tipo II recombinante-23k com base em filtração de fluxo tangencial (TFF) combinada com cromatografia em coluna de troca de ânions fracos DEAE-no modo fluxo-through, fornecendo uma solução viável para produção em grande escala.

 

Processo completo de purificação-em escala industrial

Todo o processo consiste em quatro etapas principais:

Filtração de Clarificação → Concentração e Diafiltração → Fluxo da Coluna DEAE-Através de Cromatografia → Liofilização-Secagem

 

Figura 1. Processo de separação e purificação de colágeno tipo II humanizado recombinante II-23k

 

Triagem de processos-chave

A equipe de pesquisa comparou quatro tipos de mídia de cromatografia de troca-iônica: troca aniônica-forte Q, troca aniônica-fraca DEAE, troca catiônica forte-SP e colunas de troca catiônica fraca-CM.

 

Among them, the DEAE weak anion-exchange column showed the best performance. Under a buffer condition of pH 7.0 , the column was operated in flow-through mode , achieving a target protein purity of >95% and a recovery rate of >90%, sem pigmentos residuais detectados.

 

Os processos de separação e purificação de diferentes colágenos recombinantes expressos por diferentes hospedeiros microbianos variam consideravelmente. Em geral, porém, a estratégia global pode ser dividida em separação primária e purificação fina.

 

O objetivo da separação primária é remover matéria sólida em suspensão, como células microbianas, e preparar o caldo de fermentação para posterior purificação fina. Esta etapa envolve principalmente centrifugação e filtração. As centrífugas industriais convencionais são geralmente grandes em tamanho, caras e limitadas em velocidade de rotação, resultando em eficiência de processamento relativamente baixa. A filtragem de fluxo tangencial (TFF) tem um custo operacional mais baixo e reduz efetivamente o entupimento e a incrustação da membrana associados à filtragem-de beco sem saída convencional. Portanto, o TFF tem sido amplamente aplicado na filtração de clarificação e concentração/diafiltração de caldos de fermentação contendo proteínas recombinantes.

 

O objetivo da purificação fina é melhorar ainda mais a pureza do produto removendo impurezas, como proteínas e pigmentos da célula hospedeira, por meio de técnicas cromatográficas. Entre essas tecnologias, a cromatografia de troca-iônica oferece alta resolução e forte seletividade e é amplamente utilizada para a produção em-grande escala de diversas biomoléculas.

 

Na produção industrial, a cromatografia de{0}troca iônica impõe requisitos relativamente altos à clarificação e à força iônica da amostra. Enquanto isso, o TFF pode lidar com grandes volumes de matéria-prima, é fácil de manter e oferece boa escalabilidade, tornando-o amplamente aplicável a processos de purificação downstream para bioprodutos.

 

Portanto, ao estabelecer o processo de separação e purificação para II-23k, uma membrana de fibra oca TFF de 0,22 μm foi usada para filtração de clarificação do caldo de fermentação para remover células microbianas e outras impurezas sólidas. Um cassete de membrana de folha plana TFF de 5 kDa foi então usado para concentração e diafiltração, completando o pré-tratamento antes da cromatografia. Finalmente, a cromatografia em coluna DEAE no modo flow-through foi empregada para purificação.

 

Os resultados demonstraram que o processo funcionou de forma eficaz, alcançando uma pureza do produto final de aproximadamente 95%, sem detecção de pigmentos residuais. A taxa geral de recuperação do processo completo atingiu quase 60%.

 

Melhorias adicionais na recuperação podem ser alcançadas aumentando o volume de alimentação e reduzindo a leitura do manômetro do cassete de membrana durante a fase de concentração e diafiltração. A recuperação da etapa de cromatografia pode ser potencialmente melhorada diminuindo a temperatura operacional da cromatografia e aumentando a concentração de íons salinos no tampão.

 

Referência

Meng Zixuan, Shi Weiwei, Zhang Maifei e outros. Processo de Separação e Purificação de Colágeno Tipo II Humanizado Recombinante. *Jornal Chinês de Biologia*, 2026, 43(1): 91–96.